Erregerdiagnostik
In der Infektionsdiagnostik repräsentieren molekularbiologische Techniken (PCR, qPCR, RealTime-PCR) derzeit die schnellste und sensitivste Methodik zum Direktnachweis pathogener Mikroorganismen. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ermöglicht die exponentielle Vervielfältigung definierter DNA-Sequenzen und damit den Nachweis sehr geringer Mengen von Erreger-Nukleinsäuren in verschiedensten Probenmaterialien. Die PCR ist insbesondere geeignet für den Nachweis von Infektionserregern:
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die schwierig, langsam oder gar nicht kultivierbar sind,
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in der akuten Phase einer infektiösen Erkrankung, insbesondere bevor Antikörper nachweisbar sind,
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bei immunsupprimierten Patienten, die nur eine geringe bzw. keine Antikörperantwort generieren können (z.B. im Rahmen einer HIV-Infektion, vor/nach Transplantation oder im Rahmen einer zytostatischen Chemotherapie),
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zur Bestimmung von Resistenzen.
Allgemein
HPV
Eine Infektion mit Humanen Papilloma Viren ist die häufigste sexuell übertragene Erkrankung. Man geht davon aus, dass sich 70-80% aller Personen mit HPV infizieren. Bei über 90% der Personen verläuft eine HPV-Infektion ohne Beschwerden und ohne weitere Folgen, sodass die Viren innerhalb eines Jahres im Körper des Infizierten nicht mehr nachweisbar sind. Bei 10% der infizierten Personen persistiert das Virus jedoch im Körper und vermehrt sich in den Zellen (Plattenepithel) des Gebärmutterhalses, der Vagina oder Vulva. Dadurch kann es zu Zellveränderungen (Dysplasien) kommen. Heute sind mindestens 15 verschiedene sogenannte Niedrigrisiko HPV-Typen (HPV 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 62, 70, 71, 72, 74, 81,83) als Verursacher von Genitalwarzen bzw. niedriggradigen Dysplasien beschrieben. Die Rolle von 12 Hochrisiko HPV-Typen (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59) gilt bei der Entstehung von hochgradigen Dysplasien bzw.Gebärmutterhalskrebs als gesichert, für 13 weitere (HPV 26, 30, 34, 53, 66, 67, 68, 69, 70, 73, 82, 85, 97) wird eine Beteiligung vermutet.
Die Analyse über den EuroArray HPV-Test (Euroimmun) oder dem VisionArray HPV Chip 1.0 (ZytoVision) basiert auf einer Chip-Hybridisierung, die neben den Hoch-Risiko-Typen zusätzlich die Nicht-Hoch-Risiko-HPV nachweisen und typisieren können.
CMV
Das humane CMV wird bei infizierten Menschen im Blut, im Gewebe und in nahezu allen Körperflüssigkeiten gefunden. Die Übertragung kann oral oder sexuell erfolgen, durch Bluttransfusionen und Organtransplantationen sowie intrauterin oder perinatal. Die Infektion mit CMV verläuft in den meisten Fällen symptomfrei und das Virus persistiert dann lebenslang im Körper. Wenn Symptome bei Jugendlichen oder Erwachsenen auftreten, ähneln sie denen des Pfeiffer‘schen Drüsenfiebers, mit Fieber, einer leichten Hepatitis und allgemeinem Unwohlsein. Schwere Verläufe einer CMV-Infektion werden besonders bei intrauterin infizierten und bei immundefizienten Patienten beobachtet.
Der artus CMV RG PCR Kit (QIAGEN) ist ein gebrauchsfertiges System für den Nachweis von CMV-DNA durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) auf den Rotor-Gene Q Thermocyclern. Das Kit enthält die Reagenzien und Enzyme zur spezifischen Amplifikation eines 105 bp langen Abschnitts des CMV-Genoms.
EBV
Die Übertragung des Epstein-Barr-Virus (EBV) erfolgt oral, hauptsächlich über den Speichel. Im Allgemeinen verläuft eine Infektion mit EBV symptomfrei, insbesondere, wenn sie im Kindesalter erfolgt. Klinisches Zeichen einer akuten Infektion ist eine infektiöse Mononukleose (Pfeiffer’sches Drüsenfieber) mit Fieber, Müdigkeit und Halsschmerzen sowie entzündeten Lymphknoten und entzündeter Milz. Bei manchen Patienten treten diese Symptome chronisch wieder auf. Schwere Formen einer EBV-Infektion können bei immundefizienten Patienten und Menschen mit T-Zell-Störungen auftreten.
Der artus EBV RG PCR Kit (QIAGEN) ist ein gebrauchsfertiges System für den Nachweis von EBV-DNA durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) auf den Rotor-Gene Q Thermocyclern. Das Kit enthält die Reagenzien und Enzyme zur spezifischen Amplifikation eines 97 bp langen Abschnitts des EBV-Genoms.
HSV
Herpes-simplex-Viren (HSV) findet man in Bläschenflüssigkeit, im Speichel, im Liquor cerebrospinalis und im Vaginalsekret. Sie werden hauptsächlich durch direkten Kontakt mit den Bläschen und durch Geschlechtsverkehr übertragen sowie während der Geburt. Bei den meisten HSV-positiven Fällen findet man Läsionen der Haut und Schleimhaut von Mund oder Genitalien. Die HSV-Infektion kann entweder eine Erstinfektion sein (mehr als 90 % dieser Fälle sind symptomfrei) oder ein Rezidiv.
Der HSV-1/2 RG PCR Kit (QIAGEN) ist ein gebrauchsfertiges System für den Nachweis von HSV-DNA durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) auf den Rotor-Gene Q Thermocyclern. Das Kit enthält die Reagenzien und Enzyme zur spezifischen Amplifikation eines 154 bp langen Abschnitts des Genoms von HSV-1 und HSV-2.
Mycobakterien (TBC und MOTT)
Tuberkulose (TBC) ist eine meldepflichtige Infektionskrankheit, die durch Mycobakterien, die zum so genannten Mycobacterium tuberculosis-Komplex gehören, hervorgerufen wird. Die Tuberkulose betrifft bevorzugt die Lunge, kann aber auch in jedem anderen Organ auftreten.
Atypische Mykobakterien oder Nichttuberkulöse Mykobakterien (NTM) sind eine heterogene Gruppe von Mikroorganismen mit unterschiedlicher Virulenz und pathogenem Potenzial. Bislang wurden bereits über 150 verschiedene Spezies der NTM beschrieben wobei nur ein geringer Teil bekanntermaßen humanpathogen ist. Hauptsächlich betroffen sind Menschen mit geschwächtem Immunsystem.
Der TBC-Nachweis mit dem Testsystem der Firma AnDiaTec erfolgt mittels Hydrolysesonden (TaqMan-Assay). Die dabei eingesetzte, für das TBC-PCR-Produkt spezifische, fluoreszenzmarkierte Sonde wird während der Verlängerungsphase der PCR hydrolisiert, wobei es zu einer ansteigenden Emission der Fluoreszenz kommt. Mit dem LightCycler 480 wird während der PCR laufend die Intensität des Fluoreszenzsignals ermittelt und damit die Amplifikation des spezifischen PCR-Produktes analysiert.
Bei dem VisionArray-Nachweisverfahren erfolgt die Untersuchung auf M. tuberculosis sowie atypische Mycobakterien durch Bindung eines spezifischen PCR-Produktes an Genus-spezifische Sonden auf einem Array. Der spezifische Nachweis von M. tuberculosis mit diesem System erfolgt zum einen über die IS6110-, zudem über ein 16S-23S rRNA-Sequenz. Folgende atpyische Mycobakterien können spezifisch nachgewiesen werden: M. abscessus, M. avium/intracellulare-Komplex, M. chelonae, M. chimaera, M. fortuitum, M. genavense, M. gordonae, M. haemophilum, M. kansasii, M. malmoense, M. marinum/M. ulcerans, M. scrofulaceum/M. parascrofulaceum, M. simiae, M. smegmatis, M. szulgai, M. xenopi.
TBC-Resistenz
Im Jahr 2016 waren unter den weltweit 10,4 Millionen Tuberkulose-Fällen ca. 650.000 Patienten mit multiresistenten TB-Stämmen, welche eine Behandlung und Kontrolle der Krankheit erschweren. Der Einsatz unwirksamer Antibiotika kann zu einer Ausbreitung resistenter Bakterien, sowie zu weiterer Resistenzentwicklungen führen. Zur Identifizierung der Resistenz gegenüber den zwei Erstlinien Antituberkulotika Rifampicin und Isozianid werden die wichtigsten Mutationen im rpoB (beta-Untereinheit der RNA-Polymerase), katG (Katalase-Peroxidase) und inhA (NADH-Enoyl-ACP-Reduktase)-Gen untersucht um die Diagnosestellung zu unterstützen und eine adäquate Behandlung zu gewährleisten.
Der GenoType MTBDRplus-Kit der Firma HAIN Lifescience beruht auf der DNA STRIP-Technologie und erlaubt die molekulargenetische Identifizierung des Mycobacterium tuberculosis-Komplexes und dessen Resistenz gegen Rifampicin und/oder Isoniazid. Der Nachweis einer Resistenz gegen Rifampicin wird durch den Nachweis der wichtigsten Mutationen des rpoB-Gens (Codon 505-533) geführt. Zur Identifizierung einer Isoniazid Resistenz wird das katG-Gen (Codon 315) und das inhA-Gen (Codons 8,15,16) untersucht. Dabei werden spezifische Bereiche der Tuberkulosebakterien durch PCR amplifiziert und über Sonden auf einem Streifen detektiert. Das Bandenmuster wird mithilfe einer Schablone visuell ausgewertet.
Helicobacter pylori Resistenz
Die Resistenz von Helicobacter pylori gegenüber dem Makrolid Clarithromycin ist von klinisch großer Relevanz, da es dadurch zu einer Verminderung der Effizienz der Antibiotikatherapie um durchschnittlich 55% kommt. Die Resistenz gegen Clarithromycin ist assoziiert mit einer fehlenden bzw. mangelhaften Bindung des Antibiotikums an das bakterielle Ribosom. Dies wird bei H. pylori durch Punktmutationen in der 23S rRNA verursacht. Es handelt sich hierbei um die "target site" des Clarithromycins. Die wichtigsten Mutationen, die zu einer Resistenz des Bakteriums gegenüber Fluorochinolonen führen, befinden sich in den Codons 87 und 91 des gyrA-Gens.
Der GenoType HelicoDR-Kit der Firma HAIN Lifescience beruht auf der DNA STRIP-Technologie und erlaubt die molekulargenetische Identifizierung von Helicobacter pylori und dessen Resistenz gegen Fluorchinolone und/oder Clarithromycin. Der Nachweis einer Resistenz gegen Fluorchinolone wird durch den Nachweis der wichtigsten Mutationen des gyrA-Gens (Codons 87, 91) geführt. Zur Identifizierung einer Clarithromycin-Resistenz wird das 23S-rRNA-Gen untersucht (Positionen 2146 und 2147). Dabei werden spezifische Bereiche des H.pylori-Genoms durch PCR amplifiziert und über Sonden auf einem Streifen detektiert. Das Bandenmuster wird mithilfe einer Schablone visuell ausgewertet.