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Labor

Die GENOPATH GbR beschäftigt sich innerhalb der Pathologie mit der molekularpathologischen Diagnostik.

Dieser Bereich der Pathologie umfasst die Diagnostik von Gewebeproben bzw. zytologischen Proben mit den Mitteln der modernen Molekularbiologie. Wesentlich ist hier vor allem die Analyse von Nukleinsäuren (DNA/RNA). Als Techniken werden hauptsächlich die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR), verschiedene Hybridisierungstechniken sowie die DNA- und RNA-Sequenzierung angewendet. Für letztere Methode kommt bei der GENOPATH GbR nur noch die massive Parallelsequenzierung (Next Generation Sequencing, NGS) zum Einsatz, welche gleichzeitig die Analyse einer Vielzahl von Gensequenzen erlaubt. Proteinbasierte Methoden wie FISH oder CISH, die ebenfalls zur Molekularpathologie gehören, werden im Labor der GENOPATH GbR nicht durchgeführt.

Die Molekularpathologie ist in allen Fällen der mikroskopischen Diagnostik des Pathologen zeitlich nachgeordnet und wird von den behandelnden Ärzten (z.B. Onkologen, Gynäkologen) wegen spezieller therapeutischer Fragestellungen beim Pathologen angefordert.

Weitere Informationen zur Arbeitsweise der Pathologie und des Pathologen können Sie auf den Internetseiten der Institute für Pathologie in Saarbrücken-Rastpfuhl und Bonn-Duisdorf nachlesen.

Ausstattung

Aufreinigung

Um DNA bzw. RNA aus dem eingeschickten FFPE-Material zu extrahieren, werden in unserem Labor drei Maxwell-Aufreinigungsautomaten der Firma Promega verwendet. Neben einem kleinen (RSC 16) und einem großen Maxwell (RSC 48), ist seit neuestem auch ein CE-IVD-zertifizierter Maxwell CSC 48 Teil der Laborausstattung. Über verschiedene Kits wird aus dem eingesandten Material je nach Bedarf DNA und/oder RNA aufgereinigt.

3500 Genetic Analyzer

Beim ABI 3500 Genetic Analyzer handelt es sich um einen Kapillarelektrophorese-Sequenzierer mit dem aktuell fast ausschließlich Fragmentanalysen (MSI und Lymphome) durchgeführt werden. Gensequenzierungen sind über die Sanger-Technik ebenfalls möglich wurden bei uns mittlerweile allerdings vollständig durch NGS-Methoden ersetzt.

RealTime-PCR Geräte

Neben dem abgebildeten Rotor-Gene-Q der Firma Qiagen, werden der LC480 von Roche, das QuantStudio 5 Dx von Thermofisher, sowie das EasyPGX® qPCR instrument 96 von Diatech Pharmacogenetics genutzt. Auf diesen Geräten werden verschiedene Assays durchgeführt, um gezielt Mutationen z.B. im EGFR-Gen nachzuweisen oder bei schlechtem Ausgangsmaterial die NGS-Analytik (teilweise) zu ersetzen.

Auch Erregerdiagnostik, wie der Nachweis von TBC, EBV, oder HSV wird auf diesen Geräten durchgeführt.

Auf dem QuantStudio 5 Dx wird zudem der CE-IVD-zertifizierte Endopredict-Test realisiert.

PCR-Thermocycler

Die Laborausstattung umfasst zahlreiche PCR-Thermocycler verschiedener Hersteller. Die Vervielfältigung von Nukleinsäuren über die Polymerasekettenreaktion, für die diese Geräte hauptsächlich genutzt werden, stellt die Basis zahlreicher molekularer Analysen dar. Die Geräte werden zudem für zahlreiche Inkubationen bei der Library-Präparation für die NGS-Diagnostik genutzt.

Hamilton - MicroLab STAR

Die Erstellung der Sequenzierbibliothek („Library-Prep“) kann für die NGS-Analysen über QIAseq-Panel auch automatisiert erfolgen. Der Hamilton MicroLab STAR Pipettierroboter ermöglicht die vollständige Bearbeitung der DNA/RNA bis hin zur Sequenzierbibliothek über Nacht. Dadurch wird die schnelle Durchlaufzeit der QIAseq-Proben erreicht. Es ist geplant in Zukunft auch weitere NGS-Panel auf dem Hamilton MicroLab STAR zu etablieren.

NGS über Illumina Miniseq / Nextseq

Die Sequenzierung der Libraries erfolgt auf Illumina NGS-Geräten. Aktuell besteht unsere Ausstattung aus zwei MiniSeq- und einem leistungsstärkeren NextSeq 550. Diese Sequenziergeräte ermöglichen zum einen die schnelle Abarbeitung kleiner NGS-Panel für einen zügigen Probendurchsatz, zum anderen die Analyse großer NGS-Panel wie den TSO500- oder HRD-Panel.

Methoden

NGS-Analysen

Die NGS-Analysen stellen mittlerweile die häufigste angewandte Methode im Labor der GENOPATH GbR dar. In der Tumordiagnostik werden routinemäßig verschiedenste Panel, je nach gewünschter Analyse und Ausgangsmaterial eingesetzt. Die Bandbreite erstreckt sich dabei von kompakten NGS-Paneln (z.B. QIAseq-Panel), über mittelgroße entitätsspezifische Kombi-Panel (z.B. Archer FusionPlex Lung) und umfangreichen Multigenpanel inklusive TMB-Bestimmung (z.B. Illumina TSO500) bis hin zu Spezial-Paneln beispielsweise für die Bestimmung eines HRD-scores, sarkomspezifischen Mutationen, oder auch die Mutationsanalyse aus Blut.

Erregerdiagnostik

Die durchgeführte Erregerdiagnostik umfasst die Testung auf HPV, CMV, EBV, HSVI/II, TBC, atypische Mycobakterien (MOT), sowie H. pylori. Die Analysen für den Nachweis von HPV, CMV, HSV, und EBV werden dabei ausschließlich per RT-PCR durchgeführt. Bei HPV, wie auch TBC und MOT sind verschiedene Testsysteme etabliert. Neben Hybridisierungschips werden ebenfalls verschiedene RT-PCR-Assays durchgeführt. Resistenztestungen von Mycobacterium tuberculosis und Helicobacter pylori können ebenfalls durchgeführt werden.

RealTime-PCR Analysen

RealTime-PCR Analysen werden sowohl in der Mutationsdiagnostik als auch in der Erregerdiagnostik eingesetzt. Bei ersterer ist es nicht die Standardmethode, sondern wird alternativ zur präferierten NGS-Analytik nur bei schlechtem Ausgangsmaterial oder besonders eiligen Fällen verwendet. Dies umfasst den Nachweis der gängigen Mutationen in BRAF und EGFR über das therascreen-Kit von Qiagen, sowie den Nachweis der häufigsten Translokationen der Gene ALK, ROS1, RET, NTRK und MET Exon14 skipping. Alle therapierelevanten Mutationen beim NSCLC können außerdem auf dem RT-PCR Gerät EasyPGX® qPCR instrument 96 von Diatech Pharmacogenetics nachgewiesen werden.

Auch der Endopredict-Test basiert auf der Technik der RealTime-PCR.

In der Erregerdiagnostik werden die Nachweise verschiedener Viren und Bakterien über RealTime-PCR realisiert.

Fragmentanalysen

Die durchgeführten Fragmentanalysen umfassen die Lymphomdiagnostik, genauer gesagt B- und T-Zell-Analysen, sowie die Testung auf Mikrosatelliteninstabilität. Hierbei werden DNA-Proben des Tumor- und des Normalgewebes durch Fragmentanalysen untersucht. Zur Identifikation von großen Deletionen oder Amplifikationen in den Genen  BRCA1 oder BRCA2 wird eine MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) Fragmentanalyse durchgeführt.

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